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细胞检测新品:NO、ROS、CFDA SE增殖与示踪          “完美新发明”GelBlue——安全凝胶电泳新时代         【新品】低丰度蛋白检测神器-TSA免疫荧光技术

  • YF®647A-Annexin V and PI Apoptosis Kit

    产品货号: Y6026

    产品规格: 50T/100T

    目录价(元):1350/2000

    可替代的同类产品:AF647-Annexin V & PI, FITC-Annexin V & PI

    大包装询价


产品概述:

产品内容

组分

50T

100T

A.1×Annexin V 结合缓冲液

50 mL

50 mL×2

B.YF647A-Annexin V

250 μL

500 μL

C.PI

500 μL1

1 mL


储存条件
4℃避光冷藏,请勿冻存。本产品在推荐条件下可以储存 12 个月。

产品介绍
YF647A-Annexin V 和 PI 凋亡试剂盒提供了一种快速简便的方法,通过标记早期凋亡细胞(红色 FL4或RL1通道)和坏死细胞(红色 FL3或BL3通道),用于检测细胞凋亡水平。产品可以使用流式细胞仪或其它荧光检测设备进行检测。
YF647A -Annexin V 可以标记凋亡细胞。Annexin V 选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称 PS)。在细胞发生早期凋亡时,PS 会外翻到细胞表面,即细胞膜外侧。用红色荧光探针YF647A 标记的 Annexin V,即 YF647A -Annexin V,可以结合外翻的磷酯酰丝氨酸,从而检测细胞凋亡的重要特征。我司的 YF647A 染料荧光亮度更高,且不受环境中 pH 的影响,具有良好的光稳定性。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种 DNA 结合染料,它可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞的细胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激发,呈现红色荧光。

说明书:


    UE-Y6026


常见问题解答:


为何染色结果显示细胞凋亡率过高?
1.凋亡时间处理过长,使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件,使细胞处于不同的凋亡状态。
2.假阳性染色。对于贴壁细胞,胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜,使Annexin V能够与磷脂酰丝氨酸结合。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后,使细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟,以恢复其膜完整性。

实验结果使用什么仪器观察?
实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察,但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸(PS),只是凋亡细胞膜外更多,可以结合更多的Annexin V,流式细胞仪更灵敏,可以区分出微小差异,将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群,但如果用荧光显微镜,可能观察不到这一差别,尤其是贴壁细胞。若要在成像测定中检测细胞凋亡,推荐使用SuperView™ 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells(S6007)

流式细胞仪检测细胞凋亡,结果图中的各个象限代表什么状态的细胞?
左上角:Annexin V-/PI+,坏死细胞,也可能包含少数的晚期凋亡细胞或机械损伤的细胞;右上角: AnnexinV+/PI+,晚期凋亡细胞;右下角:AnnexinV+/PI-,早期凋亡细胞;左下角:AnnexinV-/PI-,正常细胞。

这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗?
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸,包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA,由于RNA的干扰,用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时,凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 若果需要进行细胞周期检测,推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit(C6031)

◆各象限代表的细胞状态问题

Q1:(AnnexinV-染料)-/PI+,此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中,甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多,实验结果越不可信,建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+,此区域的细胞为晚期凋亡细胞。
Q3:(AnnexinV-染料)+/PI-,此区域的细胞为早期凋亡细胞。
Q4:(AnnexinV-染料)-/PI-,此区域的细胞为活细胞。

◆假阳性问题
1.对贴壁细胞而言,消化是最关键的步骤,消化液需用不含EDTA的胰酶,因为Annexin V和PS的结合需要Ca2+,而EDTA是Ca2+螯合剂,使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长,吹打细胞要轻柔,因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤,造成假阳性。细胞消化下来后,建议在培养箱中在孵育30min,使细胞膜恢复完整性,避免假阳性,或者将细胞报讯在含2% BSA的PBS中,防止进一步的损伤。
2.如果样品来源于血液,必须去除血液中的血小板,因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,干扰实验结果。
3.神经细胞膜容易破坏外翻,导致假阳性,所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。

◆荧光染料选择的问题
1.对于荧光染料的选择,建议如果流式细胞仪带有488 nm和633 nm两个或以上激光管,首先考虑用APC或YF647标记 Annexin V,因为它和PI通道几乎不用考虑光重叠问题,可以减少调节补偿的烦恼,如果只有488 nm激光管则可选择YF488/FITC标记的Annexin V。
2.再次需要考虑细胞是否自带荧光,因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带GFP荧光,GFP与YF488/FITC通道重叠,不能选择YF488/FITC标记的Annexin V,此时如果只有488 nm一根激光管可以用PE标记Annexin V,用7-AAD代替PI,或者改用YF647 Annexin V代替YF488。
3.最后还要考虑处理因素是否带有荧光,本实验室就碰到过一个促凋亡药物Doxorubicin本身发红色荧光,对PI通道的检测造成严重干扰,而且浓度越大干扰越明显。这时建议选用其他检测方法。

◆圈门问题
1.要特别注意在FSC/SSC圈门时,所选细胞范围会对结果造成较大影响,所以在分析数据时,要把所有细胞都圈进FSC/SSC的门内,这样实验结果才会更可信。如图,使细胞群大概位于对角线上,并且细胞群较集中,群内细胞比例要在80%以上,如果细胞全部圈入,细胞比例才50%或者更低,说明细胞被压在了坐标轴上,这时要重新调节FSC和SSC。

2.贴壁细胞做Annexin V凋亡检测,通常分群不太规则,这时我们可以根据不加药细胞来画不规则的十字门。如下面图形的设门方式


◆免疫染色与凋亡染色顺序问题

Annexin V凋亡染色可以和抗体一起对细胞进行染色吗?
可以,但建议Annexin V和其它抗体分开染色。 例如Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞,可以先在PBS中标记CD3/CD8后洗去,再在Binding buffer(含钙离子)中标记Annexin V

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗?
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸,包括DNARNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA,由于RNA的干扰,用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时,凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。 若果需要进行细胞周期检测,推荐Cell Cycle and Apoptosis KitC6031)

◆液氮保存的组织块,还可以做流式细胞分析吗?
液氮保存的组织块,不建议再做流式细胞分析因为流式细胞分析要求细胞分散、单个,活性好,组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡,同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片,不宜上流式检测,所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本,即取材后立即检测,效果最好。 液氮保存的组织块,可以将组织标本进行切片,然后做原位染色,观察组织细胞的凋亡。

Annexin V可以用在植物和细菌中吗?
Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡,具体实验步骤可参考相关文献。
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